31 июля 2017 г. olfa

Журнал Ліки України №3 (209) /2017

І. А. Зупанець, С. К. Шебеко, І. А. Отрішко

Національний фармацевтичний університет

Ключові слова: антиапоптозна активність; мельдоній; гама-бутиробетаїн; церебральна ішемія

Ключовою умовою підтримки гомеостазу в багатоклітинних організмах є природний баланс між розподілом і загибеллю клітин. Встановлено, що поряд з програмою, яка регулює клітинний розподіл, існує особлива генетична програма, яка забезпечує визначений за часом життєвий цикл клітини і при несприятливих умовах призводить її до загибелі [2, 4, 16]. У нормі основна біологічна роль такої генетично запрограмованої смерті полягає у встановленні потрібної рівноваги між процесами проліферації і загибелі клітин, що в одних ситуаціях забезпечує стабільний стан організму, в інших – ріст, в третіх – атрофію тканин і органів.

За умов патології ушкодження органів починається на молекулярному або клітинному рівні. Реакція клітин на пошкодження залежить від типу, тривалості дії і тяжкості фактора, що ушкоджує. За несприятливих умов розвивається смерть клітини, як кінцевий результат її пошкодження або дегенеративно-дистрофічних змін [15]. Клітинна смерть при такому варіанті розвитку подій може відбуватися як шляхом некрозу, так і апоптозу [8, 13].

Таким чином, апоптоз є загальним механізмом запрограмованої загибелі клітин в нормальних і патологічних процесах [2, 3, 16], а детермінація загибелі клітин та її регуляція – однією з центральних проблем клітинної біології.

Ішемія головного мозку викликає розвиток гіпоксії, яка запускає каскад патологічних процесів, що призводять до загибелі нейроцитів, в основному, шляхом некрозу. Апоптоз – морфологічний прояв запрограмованої загибелі нейроцитів, асоціюється, в першу чергу, з нормальним функціонуванням центральної нервової системи. Однак, при ряді патологічних станів, в т.ч. і церебральній ішемії, рівень апоптозу істотно зростає [11].

Отже, дослідження апоптозу є важливим і високоінформативним елементом не тільки вивчення механізмів розвитку ішемічного ураження головного мозку, а й способом контролю ефективності проведеної церебропротекторної терапії.

У зв'язку з цим, з метою поглибленого вивчення механізмів церебропротекторної дії Капікору значний науковий і практичний інтерес представляє дослідження процесів апоптозу в ішемізованих тканинах головного мозку тварин на тлі розвитку гострого порушення мозкового кровообігу (ГПМК), що і стало метою даного дослідження.

Матеріали та методи

Експерименти проводились у відповідності з директивою Ради ЄС 2010/63/EU про дотримання законів, постанов та адміністративних положень держав ЄС з питань захисту тварин, що використовуються для експериментальної та іншої наукової мети [10].

Вивчення церебропротекторних властивостей препарату „Капікор” проведено на моделі гострого порушення мозкового кровообігу [‎1, 11] на 90 білих нелінійних щурах, обох статей, масою 180-200 г, які були розподілені на 5 дослідних груп наступним чином: 1 група – інтактний контроль (10 тварин); 2 група – контрольна патологія (20 тварин); 3 група – щурі з ГПМК, що отримували Капікор у дозі 56,5 мг/кг (за сумою діючих речовин), що відповідає ЕД₅₀ за церебропротекторною активністю (20 тварин); 4 група – щурі з ГПМК, які отримували Мілдронат в еквівалентній дозі 42,4 мг/кг (20 тварин); 5 група – щурі з ГПМК, які отримували субстанцію гама-бутиробетаїну (ГББ) в еквівалентній дозі 14,1 мг/кг (20 тварин).

Починаючи з першого дня експерименту і протягом 20 днів, всі тварини отримували досліджуваний і референтні препарати у відповідних дозах, щодня одноразово шляхом в/ш введення за допомогою зонда у вигляді водних розчинів або суспензій в загальному об’ємі 0,5 мл. Тварини груп інтактного контролю і контрольної патології отримували еквівалентну кількість фізіологічного розчину. На 5-ту добу дослідження через годину після останнього введення препаратів у тварин проводили відтворення ГПМК шляхом білатеральної оклюзії загальних сонних артерій [1, 9, 11, 14].

Кількісний аналіз інтенсивності апоптозу виконували методом розрахунку індексу апоптозу (ІА) – відношення числа TUNEL-позитивних клітин до загальної кількості клітин в полі зору, вираженого у відсотках.

Ідентифікацію апоптозних клітин в тканинах головного мозку проводили імуногістохімічно на напівтонких парафінових зрізах методом TUNEL-реакції (Tdt-mediated X-DUTP nick end labeling) за допомогою наборів «In Situ Cell Death Detection Kit, АР» виробництва «Roche Diagnostics» (Німеччина) (кат. №.11 684 809 910, сер.№ 11888800) [8].

Загальну статистичну обробку результатів проводили методами варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента та непараметричних методів аналізу (Mann-Whitney U Test) за допомогою комп'ютерної програми STATISTIСА 7.0, StatPlus 2009 і MS Exel 2007 [5-7] і представляли у вигляді порівняльних таблиць з результатами різних груп.

Результати та їх обговорення

У ході цього дослідження були виготовлені мікропрепарати зі свідомо відсутнім і присутнім апоптозним маркуванням клітин (негативний і позитивний контроль – рис. 1 А, 1 Б відповідно).

Клітини, що мають червоне / червоно-синє / червоно-коричневе забарвлення по периметру ядра або містять ядерні фрагменти в цитоплазмі, реєструвалися як TUNEL-позитивні (рис. 1 Б). У негативному контролі подібні клітини були відсутні (рис. 1 А).

При вивченні мікропрепаратів дослідних груп було виявлено, що у всіх групах є TUNEL-позитивне забарвлення у всіх зонах кори, гіпокампа і білої речовини в обох півкулях. Морфологія апоптозних клітин була незмінною, незалежно від місця локалізації.

З огляду на те, що в білій речовині апоптозу піддаються лише гліальні клітини, а також той факт, що спостерігається пряма залежність між рівнем апоптозу в різних зонах, ми зупинимося на описі апоптозу в сенсомоторній зоні кори і гіпокампі.

У групі інтактних тварин клітини з TUNEL-позитивним забарвленням зустрічалися не в кожному полі зору (рис. 1 В), але в кожному мікропрепараті. При розрахунку індексу апоптозу його величина в цій групі склала 2,79% (рис. 2).

Індекс аптозу %

При дослідженні мікропрепаратів в групі контрольної патології було виявлено достовірне посилення апоптозу на тлі відтворення порушення кровопостачання головного мозку у щурів. Так, церебральна ішемія приводила до збільшення рівня апоптозу в тканинах мозку тварин даної групи в 5 разів у порівнянні з інтактною, про що свідчить ІА, який в цій групі склав 13,78% (рис. 2). У мікропрепаратах в кожному полі зору зустрічалося до 16-17 клітин з TUNEL-позитивним забарвленням. Особливо щільно апоптозні клітини були розташовані в III – V шарах кори і гіпокампі (рис. 1 Г). На окремих ділянках виявляли цілі групи нейроцитів в стані апоптозу. Більшість клітин містили ядра, забарвлені в синій колір, по периметру яких темно-червоним / червоно-коричневим чітко профарбовувався фрагментований хроматин. У частині клітин фрагменти ДНК виявлялися також в цитоплазмі у вигляді червоних грудочок ядерного хроматину.

При використанні Капікору для лікування щурів з ГПМК число TUNEL-позитивних клітин, що містять чітко профарбовані мітки ядра і цитоплазми, знижувалося до 4,94%, що майже в 3 рази було менше, ніж у тварин групи контрольної патології і не мало статистичних відмінностей від інтактної групи (рис. 2). Дані клітини були рівномірно розподілені по всіх зонах головного мозку. При цьому в полі зору мікроскопа, як правило, спостерігалося не більше 2-3 апоптозних клітин (рис. 1 Д, 1 Е).

Рідко зустрічаються випадки апоптозу, які характеризувалися поліморфізмом. Так, значна частина TUNEL-позитивних клітин перебувала на початковій стадії процесу, що візуалізувалося забарвленням по периметру ядра. Лише поодинокі апоптозні клітини були на стадії завершення процесу, що характеризувалося повним здавленням ДНК ядра в щільну грудочку з темно червоно-синім забарвленням.

При вивченні мікропрепаратів тварин, які отримували Мілдронат, виявлялася морфологічна картина ідентична вищеописаній, але з більш вираженими ознаками патології. Так, частка специфічно забарвлених апоптозних клітин знижувалася до 6,80%, що було достовірно в 2 рази менше, ніж в групі контрольної патології, але тим не менш, статистично не досягало інтактного рівня (рис. 2). TUNEL-позитивні клітини були рівномірно розподілені по всіх зонах головного мозку, при цьому в більшості полів зору ідентифікувалися не більше 3-4 клітин в стані апоптозу (рис. 1 Ж). Як правило, у таких клітин виявлялося інтенсивне зафарбовування ядра по периметру, що вказує на початкову стадію розвитку апоптотичного процесу, зрідка спостерігалися цитоплазматичні мітки.

На відміну від вищеописаної картини, лікування тварин з ГПМК субстанцією ГББ призводило до зниження рівня частки TUNEL-позитивних клітин – до 9,66%, що в 1,4 рази було менше, ніж у групі контрольної патології, але не відрізнялося від неї достовірно, а також поступалося показнику тварин, які отримували Капікор (рис. 2).

Найбільш часто клітини з ознаками апоптозного маркування спостерігалися в III – V шарах кори головного мозку щурів, при цьому в полі зору, як правило, виявлялося не більше 4-5 TUNEL-позитивних клітин, з різним ступенем виразності апоптозного маркування. При вивченні мікропрепаратів в одному полі зору можна було виявити клітини на пізніх стадіях апоптозу та ті, які тільки вступають в даний процес (рис. 1 З). Більшість випадків апоптозу в даній групі характеризувалися поліморфізмом.

Таким чином, аналізуючи отримані дані, можна зробити висновок про те, що загибель нейроцитів і гліальних клітин після розвитку ішемії головного мозку відбувається не тільки шляхом некрозу, а й пов'язана з активацією апоптозу. Хоча апоптозні клітини виявляються і в інтактних тканинах мозку, їх кількість при цьому незначна, вони розташовані випадковим чином і не є характерною рисою морфологічно нормального головного мозку. Після розвитку ішемії виявляється значна популяція змінених нейроцитів і гліальних клітин з наявністю незворотних апоптозних процесів. При цьому число клітин з ознаками апоптозу зростає в 5 разів. Змінюється і локалізація таких клітин – вони концентруються переважно в глибоких шарах кори і гіпокампу.

Всі препарати, вивчені в ході даного експерименту, в тій чи іншій мірі інгібували ішемічний проапоптозний ефект, але найбільшою мірою антиапоптозна дія була виражена при використанні Капікору для лікування тварин з ГПМК.

Зменшення кількості апоптозних клітин під впливом Капікору можна пояснити його регуляторним впливом на процеси метаболізму нейронів, що сприяє збалансуванню енергопродукції та їх клітинного гомеостазу за умов ішемії, і, як наслідок, призводить до підвищення їх стійкості до агресивного впливу гіпоксії, вільних радикалів, медіаторів запалення та інших факторів несприятливих умов існування в патологічно змінених тканинах головного мозку.

Результати проведених досліджень підтвердили вагому роль антиапоптозної складової в механізмі церебропротекторної дії Капікору. За умов розвитку ГПМК даний препарат суттєво інгібує активацію апоптозу нейроцитів і гліальних клітин в структурах головного мозку, викликану ішемією, та за рівнем антиапоптозної активності достовірно перевершує референс-препарат ГББ і недостовірно – Мілдронат.

ВИСНОВКИ

1. За результатами імуногістохімічних досліджень Капікор виявляє нейропротекторні властивості, забезпечує збереження якісної і кількісної структури тканин головного мозку і гальмує розвиток процесів апоптозу.

2. Антиапоптозна складова відіграє найважливішу роль в механізмі церебропротекторної дії Капікору.

3. За рівнем впливу на процеси апоптозу Капікор за сукупністю досліджених показників достовірно перевершує активність референс-препарату гама-бутиробетаїну, а за рядом параметрів – і вплив Мілдронату.

ЛІТЕРАТУРА

Доклиническое изучение специфической активности потенциальных нейропротективных препаратов : Методические рекомендации ГФЦ МЗ Украины / И.С. Чекман, Ю.И. Губский, И.Ф. Беленичев и др. – К., 2010. – 81 с.
Егорова И.Ф., Серов Р.А. Апоптоз и некроз: взаимоотношение явлений // Морфология. – 2004. – Т. 126, № 4. – С. 71-75.
Лушников У.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с.
Матвеева Н.Ю. Апоптоз: морфологические особенности и молекулярные механизмы // Pacific Medical Journal. – 2003. – № 4. – С. 12-16.
Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. – 3-е изд. – М.: МедиаСфера, 2006. – 312 с.
Сергиенко В.И. Математическая статистика в клинических исследо-ваниях / В.И. Сергиенко, И.Б. Бондарева. – 2-е изд., перераб. и доп. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2006. – 304 с.
Трухачева Н.В. Математическая статистика в медико-биологических исследованиях с применением пакета Statistica / Н.В. Трухачева. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 379 с.
Apoptosis, Cytotoxicity and Cell Proliferation / Ed. H.J. Rode. – 4-th edition. – Mannheim: Roche Diagnostics GmbH, 2008. – 180 p.
Experimental models of brain ischemia: a review of techniques, magnetic resonance imaging, and investigational cell-based therapies / A. Canazza, L. Minati, C. Boffano et al. // Frontiers in Neurology. – 2014. – Vol. 5. – Article 19. – 15 p. – Doi : 10.3389/fneur.2014.00019.
European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purpose : Council of Europe. – Strasbourg, 1986. – 52 p.
Farkas E. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases / E. Farkas, P.G.M. Luiten, F. Bari // Brain Research Reviews. – 2007. – Vol. 54, No. 1. – P. 162-180.
Fischer U. New approaches and therapeutics targeting apoptosis in disease / U. Fischer, K. Schulze-Osthoff // Pharmacol Rev. – 2005. – Vol. 57. – P. 187-215.
Kroemer G. Classification of cell death: Recommendations of the nomenclature committee on cell death / G. Kroemer, W.S. El Deiry, P. Golstein // Cell Death Differ. – 2005. – No. 12. – P. 1463-1467.
Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke / T.M. Woodruff, J. Thundyil, Sung-Chun Tang et al. // Molecular Neurodegeneration. – 2011. – Vol. 6, No. 11. – 19 p. – Doi : 10.1186/1750-1326-6-11.
Sharma A.K. Activation of apoptotic processes during transition from hypertrophy to heart failure in guinea pigs / A.K. Sharma, S. Dhingra, N. Khaper, P.K. Singal // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2007. – Vol. 293. – P.1384-1390.
Taylor R.C. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level / R.C. Taylor, S.P. Cullen, S.J. Martin // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2008. – No. 9. – P. 231-241.